Περιγραφή προϊόντων

Γρήγορη εξάρτηση V2 προετοιμασιών βιβλιοθήκης DNA

[Όνομα προϊόντων]

Γρήγορη εξάρτηση V2 προετοιμασιών βιβλιοθήκης DNA

[Γάτα. Αριθ. /Spec.]

K001S-A/24 rxns K001S-B/96 rxns σάκος 6 δειγμάτων rxns

[Περιγραφή προϊόντων]

Στοχεύοντας στην υψηλός-ρυθμοαπόδοση Illumina που τοποθετεί διαδοχικά την πλατφόρμα, αυτή η εξάρτηση παρέχει ένα κατάλληλο και καθολικό σχέδιο κατασκευής βιβλιοθηκών DNA σε έναν σωλήνα. Συνδυάζει την επισκευή και την α-παρακολούθηση τελών σε ένα βήμα, κονταίνοντας πολύ το χρόνο της κατασκευής βιβλιοθηκών και μειώνοντας το λάθος που προκαλείται από τα κουραστικά βήματα. Η προετοιμασία τελών, ligation προσαρμοστών, η ενίσχυση και ο καθαρισμός του τεμαχισμένου double-stranded DNA μπορούν να εκτελεσθούν περίπου μέσα σε 2 ώρες. Ο πλήρης προσδιορισμός της ποσότητας βιβλιοθηκών μπορεί να εκτελεσθεί με τη φθορισμού μέθοδο χρωστικών ουσιών dsDNA (π.χ., θερμο ευκίνητο Fluorometer Qubit) ή απόλυτο PCR προσδιορισμού της ποσότητας μετά από να αραιώσει τη βιβλιοθήκη σε μια κατάλληλη συγκέντρωση.

[Τύπος δειγμάτων]

[Όρος αποθήκευσης & ζωή του προϊόντος στο ράφι]

Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αποθηκευτούν Ligation -20°C. στον απομονωτή είναι κανονικά για τα κρύσταλλα να κατακρημνίσουν στις χαμηλές θερμοκρασίες, πρέπει να ισορροπηθεί στη θερμοκρασία δωματίου πριν τη χρήση. Το προϊόν ισχύει για 12 μήνες.

[Συστατικά]

* Εάν υπάρχουν περισσότερα από ένα δείγματα, το μίγμα εγχυτήρων προσαρμοστών #K002 και #K003 συστήνεται. Αυτή η εξάρτηση παρέχει σε ένα σύνολο εγχυτήρων το δείκτη.

Σημείωση: συνιστώμενες χάντρες επιλογής: Επιλογή Magbeads DNA #NC1011 GDSPure ή χάντρες AMPure XP.

[Σημειώσεις]

1. Προσφέρουμε δύο τύπους καθολικών εγχυτήρων προσαρμοστών καθορισμένων (προσαρμοστής GDS, #K002 και #K003, που αγοράζονται χωριστά), αλλά οι πελάτες μπορούν επίσης να επιλέξουν από άλλους κατασκευαστές ή να συνθέσουν τον προσαρμοστή τους για το Illumina τοποθετώντας διαδοχικά την πλατφόρμα. Πάρα πολύς προσαρμοστής θα οδηγήσει στο σχηματισμό dimer προσαρμοστών, και ο ανεπαρκής προσαρμοστής θα οδηγήσει στη χαμηλή παραγωγή βιβλιοθηκών. Επομένως, η κατάλληλη συγκέντρωση προσαρμοστών καθορίζει τη συγκέντρωση και την ποιότητα της βιβλιοθήκης. Οι συνιστώμενες συγκεντρώσεις προσαρμοστών για τα διαφορετικά ποσά εισαγωγής DNA παρουσιάζονται στον ακόλουθο πίνακα:

Πίνακας 1 συνιστώμενες συγκεντρώσεις χρήσης του προσαρμοστή

* Προσαρμοστής: Η αναλογία τυφλοπόντικων ενθέτων αναφέρεται στην αναλογία του μοριακού αριθμού προσαρμοστών από άλλες πηγές στο μοριακό αριθμό DNA εισαγωγής, ο οποίος μπορεί να υπολογιστεί κατά προσέγγιση αναφορικά με στον ακόλουθο τύπο:

Μάζα DNA αριθμού DNA εισαγωγής (pmol) ≈Input (NG)/[μέσο μήκος DNA 0.66×Input (σημείο ζέσεως)]

*The η ποιότητα και η συγκέντρωση του προσαρμοστή έχουν επιπτώσεις πολύ στην παραγωγή της βιβλιοθήκης, ειδικά για τις χαμηλές βιβλιοθήκες εισαγωγής. Ο προσαρμοστής από μια υψηλής ποιότητας πηγή πρέπει να επιλεχτεί και να αραιωθεί σε μια κατάλληλη συγκέντρωση με 0.1×TE πριν από ligation. Για την άμεση χρήση, εξασφαλίστε ότι κάθε προσθήκη δειγμάτων είναι σταθερά 5 μl, αποφεύγει τα λάθη προσθηκών δειγμάτων, και προσπαθεί να αποφύγει επαναλαμβανόμενος freeze-thaw.

2. Το ένζυμο που χρησιμοποιείται στο ΥΨΗΛΉΣ ΠΙΣΤΌΤΗΤΑΣ PCR βιβλιοθήκης 2× κύριο μίγμα είναι μια πολυμεράση οικογενειακού DNA Β, που αναπτύσσει 5 “- 3” πολυμεράση και 3 “- 5” δραστηριότητες exonuclease, αλλά στερείται 5 “- 3” δραστηριότητες exonuclease. Έχει την υψηλή πίστη και την ομοιογένεια, και την ισχυρή βιώσιμη δυνατότητα σύνθεσης. Ο αυστηρός έλεγχος του αριθμού κύκλων ενίσχυσης είναι ιδιαίτερα σημαντικός για την παραγωγή βιβλιοθηκών. Ο ακόλουθος πίνακας παρουσιάζει συστημένος αριθμό κύκλων ενίσχυσης που αντιστοιχούν στα διαφορετικά ποσά του DNA που εισάγονται:

Πίνακας 2 συνιστώμενος αριθμός κύκλων ενίσχυσης που αντιστοιχούν στις διαφορετικές εισαγωγές δειγμάτων

Σημείωση: 1. Ο ανωτέρω πίνακας παρουσιάζει αποτελέσματα της δοκιμής χρησιμοποιώντας 150bp τυποποιημένο DNA, το οποίο είναι για την αναφορά μόνο.

2. Εάν οι ελλιπείς συνδετήρες χρησιμοποιούνται, ένας ελάχιστος αριθμός κύκλων (1-3) πρέπει να ενισχυθεί για να λάβει μια πλήρη βιβλιοθήκη.

3. Εάν η ποιότητα του DNA εισαγωγής είναι κακή, ή η επιλογή μεγέθους πραγματοποιείται κατά τη διάρκεια της κατασκευής βιβλιοθηκών, ο αριθμός κύκλων ενίσχυσης πρέπει να αυξηθεί κατάλληλα.

[Τυποποιημένη διαδικασία κατασκευής βιβλιοθήκης]

Επισκευή τελών

Σημείωση: Εάν το τεμαχισμένο DNA υπερβαίνει 45 μl πριν από αυτό το βήμα, ή ο απομονωτής είναι ασυμβίβαστος με τον απομονωτή επισκευής τελών, ένας μαγνητικός καθαρισμός χαντρών πρέπει να εκτελεσθεί πρώτα.

1. Προετοιμάστε την ακόλουθη αντίδραση σε έναν PCR 200 μl σωλήνα:

2. Η δίνη ήπια και η περιστροφή κάτω εν συντομία που αναμιγνύει καλά, υποβάλλουν εν συντομία και συλλέγουν όλο το υγρό σε φυγοκέντρωση στο κατώτατο σημείο του σωλήνα.

3. Εκτελέστε την ακόλουθη αντίδραση σε ένα θερμικό cycler:

Ligation προσαρμοστών

1. Συνεχίστε με τη ligation αντίδραση το συντομότερο δυνατό μετά από την προετοιμασία τελών.

2. Αραιώστε τον προσαρμοστή σύμφωνα με τον πίνακα 1.

3. Προετοιμάστε το ακόλουθο σύστημα αντίδρασης:

4. Η δίνη ήπια και η περιστροφή κάτω εν συντομία που αναμιγνύει καλά, υποβάλλουν εν συντομία και συλλέγουν όλο το υγρό σε φυγοκέντρωση στο κατώτατο σημείο του σωλήνα.

5. Εκτελέστε την ακόλουθη αντίδραση σε ένα θερμικό cycler:

Συνιστώμενη λύση για PCR τον καθαρισμό/την επιλογή μεγέθους (ο συγκεκριμένος μαγνητικός όγκος χαντρών πρέπει να ρυθμιστεί σύμφωνα με το πραγματικό μέγεθος του δείγματος)

1. Προετοιμάστε 100 ligation μl προϊόντα σε έναν κατάλληλο σωλήνα φυγοκεντρωτών.

2. Προσθέστε 100 μl των επαναρτημένων μαγνητικών χαντρών επιλογής DNA στο δείγμα. Ήπια φυσήξτε με ένα σιφώνιο για 10 φορές (ή δίνη για τη δεκαετία του '30). Επωάστε τα δείγματα για 5 λ. στη θερμοκρασία δωματίου.

3. Τοποθετήστε το σωλήνα σε ένα κατάλληλο μαγνητικό ράφι για να χωρίσετε τις χάντρες από το υπερκείμενο νερό. Όταν η λύση είναι σαφής, αφαιρέστε προσεκτικά και απορρίψτε το υπερκείμενο νερό με ένα σιφώνιο (μην απορρίψτε τις χάντρες).

4. Προσθέστε 200 μl προετοιμασμένο 80% πρόσφατα της αιθανόλης στο σωλήνα ενώ στο μαγνητικό ράφι. Επωάστε στη θερμοκρασία δωματίου για τη δεκαετία του '30, και έπειτα προσεκτικά αφαιρέστε και απορρίψτε το υπερκείμενο νερό (μην ενοχλήστε τις χάντρες).

5. Επαναλάβετε το βήμα 4 μιά φορά για συνολικά δύο πλυσίματα.

Σημείωση: Να είστε βέβαιος να αφαιρέσει όλο το ορατό υγρό μετά από το δεύτερο πλύσιμο.

6. Στεγνώστε τις χάντρες έως ότου δεν έχει η επιφάνεια των μαγνητικών χαντρών καμία προφανή ερμηνεία ενώ ο σωλήνας είναι στο μαγνητικό ράφι με το καπάκι ανοικτό.

Σημείωση: Όχι overdry οι χάντρες, αυτό μπορεί να οδηγήσει στη χαμηλότερη αποκατάσταση του DNA. Όταν οι χάντρες αρχίζουν να ραγίζουν, είναι πάρα πολύ ξηρές.

7. Αφαιρέστε το σωλήνα από το μαγνητικό ράφι. Προσθέστε τον απομονωτή εκλεκτικής προσρόφησης 22 μl (tris-HCL, pH8.0-8.5 10mM) στο σωλήνα. Μίγμα καλά με να εισαγάγει στο σιφώνιο πάνω-κάτω τουλάχιστον 10 φορές ή σε έναν αναμίκτη δίνης για τη δεκαετία του '30. Επωάστε για 3-5 λ. στη θερμοκρασία δωματίου.

8. Τοποθετήστε το σωλήνα στο μαγνητικό ράφι. Μετά από 5 λ. (ή όταν η λύση είναι σαφής), μεταφέρετε το υπερκείμενο νερό 20 μl σε έναν νέο σωλήνα. Η επιλογή ολοκληρώνεται, και το επιλεγμένο DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τα επόμενα πειράματα ή να αποθηκευτεί σε -20°C για πολύ καιρό.

Ενίσχυση βιβλιοθήκης

1. Προετοιμάστε την ακόλουθη αντίδραση σε έναν PCR 200 μl σωλήνα:

2. Η δίνη ήπια και η περιστροφή κάτω εν συντομία που αναμιγνύει καλά, υποβάλλουν εν συντομία και συλλέγουν όλο το υγρό σε φυγοκέντρωση στο κατώτατο σημείο του σωλήνα.

3. Εκτελέστε την ακόλουθη αντίδραση σε ένα θερμικό cycler:

Συνιστώμενη λύση για PCR τον καθαρισμό/την επιλογή μεγέθους (ο συγκεκριμένος μαγνητικός όγκος χαντρών πρέπει να ρυθμιστεί σύμφωνα με το πραγματικό μέγεθος του δείγματος)

1. Προετοιμάστε 50 ligation μl προϊόντα σε έναν κατάλληλο σωλήνα φυγοκεντρωτών.

2. Προσθέστε 45 μl των επαναρτημένων μαγνητικών χαντρών επιλογής DNA στο δείγμα. Ήπια φυσήξτε με ένα σιφώνιο για 10 φορές (ή δίνη για τη δεκαετία του '30). Επωάστε τα δείγματα για 5 λ. στη θερμοκρασία δωματίου.

3. Τοποθετήστε το σωλήνα σε ένα κατάλληλο μαγνητικό ράφι για να χωρίσετε τις χάντρες από το υπερκείμενο νερό. Όταν η λύση είναι σαφής, αφαιρέστε προσεκτικά και απορρίψτε το υπερκείμενο νερό με ένα σιφώνιο (μην απορρίψτε τις χάντρες).

4. Προσθέστε 200 μl προετοιμασμένο 80% πρόσφατα της αιθανόλης στο σωλήνα ενώ στο μαγνητικό ράφι. Επωάστε στη θερμοκρασία δωματίου για τη δεκαετία του '30, και έπειτα προσεκτικά αφαιρέστε και απορρίψτε το υπερκείμενο νερό (μην ενοχλήστε τις χάντρες).

5. Επαναλάβετε το βήμα 4 μιά φορά για συνολικά δύο πλυσίματα.

Σημείωση: Να είστε βέβαιος να αφαιρέσει όλο το ορατό υγρό μετά από το δεύτερο πλύσιμο.

6. Στεγνώστε τις χάντρες έως ότου δεν έχει η επιφάνεια των μαγνητικών χαντρών καμία προφανή ερμηνεία ενώ ο σωλήνας είναι στο μαγνητικό ράφι με το καπάκι ανοικτό.

Σημείωση: Όχι overdry οι χάντρες, αυτό μπορεί να οδηγήσει στη χαμηλότερη αποκατάσταση του DNA. Όταν οι χάντρες αρχίζουν να ραγίζουν, είναι πάρα πολύ ξηρές.

7. Αφαιρέστε το σωλήνα από το μαγνητικό ράφι. Προσθέστε τον απομονωτή εκλεκτικής προσρόφησης 22 μl (tris-HCL, pH8.0-8.5 10mM) στο σωλήνα. Μίγμα καλά με να εισαγάγει στο σιφώνιο πάνω-κάτω τουλάχιστον 10 φορές ή σε έναν αναμίκτη δίνης για τη δεκαετία του '30. Επωάστε για 3-5 λ. στη θερμοκρασία δωματίου.

8. Τοποθετήστε το σωλήνα στο μαγνητικό ράφι. Μετά από 5 λ. (ή όταν η λύση είναι σαφής), μεταφέρετε το υπερκείμενο νερό 20 μl σε έναν νέο σωλήνα. Η επιλογή ολοκληρώνεται, και το επιλεγμένο DNA μπορεί να αποθηκευτεί σε 2-8°C για 1-2 εβδομάδες ή να αποθηκευτεί σε -20°C για πολύ καιρό.

[Παράρτημα] συνιστώμενο σχέδιο για τη Double-Sided επιλογή

Εάν διπλός-γύρω από η επιλογή απαιτείται, παρέχουμε το ακόλουθο σχέδιο να επιλέξουμε τον κατάλληλο μαγνητικό όγκο χαντρών σύμφωνα με το αναμενόμενο μέγεθος βιβλιοθηκών. Η επιλογή μεγέθους μπορεί να εκτελεσθεί πριν από την επισκευή τελών ή μετά από την ενίσχυση. Δύο ή περισσότερο διπλός-γύρω από την επιλογή θα μειώσουν πολύ την παραγωγή βιβλιοθηκών.

Γεμίστε τον όγκο βιβλιοθηκών στον πίνακα κατωτέρω σε 100 μl. Επιλέξτε τον όγκο των μαγνητικών χαντρών σε δύο κύκλους σύμφωνα με το αναμενόμενο μέγεθος βιβλιοθηκών. Και διενεργήστε τη λειτουργία επιλογής σύμφωνα με τις ακόλουθες οδηγίες.

Πίνακας 3 συνιστώμενο ποσό μαγνητικών χαντρών για την διπλός-στρογγυλή επιλογή

1. Γεμίστε τον όγκο βιβλιοθηκών σε 100 μl σε έναν PCR 200μl σωλήνα και επονομαζόμενος ως Α. Add έναν ορισμένο όγκο των μαγνητικών χαντρών σύμφωνα με τον πίνακα 3 (γύρω από 1) στο χτύπημα Α. Gently σωλήνων με ένα σιφώνιο για τη δεκαετία του '30. Επωάστε τα δείγματα για 5 λ. στη θερμοκρασία δωματίου.

2. Τοποθετήστε το σωλήνα Α σε ένα κατάλληλο μαγνητικό ράφι για να χωρίσετε τις χάντρες από το υπερκείμενο νερό. Όταν η λύση είναι σαφής, αφαιρέστε προσεκτικά το υπερκείμενο νερό σε έναν νέο σωλήνα και το ονομάστε ως χάντρες Β. Discard.

3. Προσθέστε έναν ορισμένο όγκο των μαγνητικών χαντρών σύμφωνα με τον πίνακα 3 (γύρω από 2) στο σωλήνα το Β. Ήπια φυσήξτε με ένα σιφώνιο για τη δεκαετία του '30. Επωάστε τα δείγματα για 5 λ. στη θερμοκρασία δωματίου. Τοποθετήστε το σωλήνα Β στο μαγνητικό ράφι. Όταν η λύση είναι σαφής, αφαιρέστε προσεκτικά και απορρίψτε το υπερκείμενο νερό.

4. Προσθέστε 200 μl προετοιμασμένο 80% πρόσφατα της αιθανόλης στο σωλήνα Β ενώ στο μαγνητικό ράφι. Επωάστε στη θερμοκρασία δωματίου για τη δεκαετία του '30, και έπειτα προσεκτικά αφαιρέστε και απορρίψτε το υπερκείμενο νερό (μην ενοχλήστε τις χάντρες).

5. Επαναλάβετε το βήμα 6 μιά φορά για συνολικά δύο πλυσίματα.

Σημείωση: Να είστε βέβαιος να αφαιρέσει όλο το ορατό υγρό μετά από το δεύτερο πλύσιμο.

6. Στεγνώστε τις χάντρες έως ότου δεν έχει η επιφάνεια των μαγνητικών χαντρών καμία προφανή ερμηνεία ενώ ο σωλήνας Β είναι στο μαγνητικό ράφι με το καπάκι ανοικτό.

Σημείωση: Όχι overdry οι χάντρες, αυτό μπορεί να οδηγήσει στη χαμηλότερη αποκατάσταση του DNA. Όταν οι χάντρες αρχίζουν να ραγίζουν, είναι πάρα πολύ ξηρές.

7. Αφαιρέστε το σωλήνα Β από το μαγνητικό ράφι. Προσθέστε τον απομονωτή εκλεκτικής προσρόφησης 22 μl στο σωλήνα. Μίγμα καλά με να εισαγάγει στο σιφώνιο πάνω-κάτω τουλάχιστον 10 φορές ή σε έναν αναμίκτη δίνης για τη δεκαετία του '30. Επωάστε για 3-5 λ. στη θερμοκρασία δωματίου.

Σημείωση: Εάν στοχεύει συλλάβετε δεν θα εκτελεσθεί, προσθέτει τον απομονωτή εκλεκτικής προσρόφησης (tris-HCL 10mM, pH 8.0-8.5) για την εκλεκτική προσρόφηση. Διαφορετικά, το αποστειρωμένο νερό ultrapure πρέπει να χρησιμοποιηθεί για την εκλεκτική προσρόφηση.

• Σωλήνας Β θέσεων στο μαγνητικό ράφι. Μεταφορά 20 υπερκείμενο νερό μl σε έναν νέο σωλήνα.

Για την ερευνητική χρήση μόνο