Πρώτα STRAND CDNA σύνθεσης αντίστροφα Transcriptase PCR εξαρτήσεων R1011/R1012 αντιδραστήρια

RT - PCR εξάρτηση

Για την ερευνητική χρήση μόνο

Γάτα αριθ. R1011, 20 rxns

Γάτα αριθ. R1012, 100 rxns

Συστατικά της εξάρτησης

Αποθήκευση

Όλα τα συστατικά της εξάρτησης πρέπει να αποθηκευτούν σε -20°C. κρατούν το RNA ελέγχου σε -70°C για την πιό μακροχρόνια αποθήκευση.

Περιγραφή

Rt-pcr η εξάρτηση βελτιστοποιείται για να συνθέσει το πρώτος-σκέλος cDNA από καθαρισμένο πολυ (Α) + ή να συμπληρώσει συνολικά το RNA. Η εξάρτηση rt-pcr για το rt-pcr παραδίδει τις αυξανόμενες cDNA παραγωγές, την υψηλή ευαισθησία, και τα ολόκληρα αντίγραφα με ένα κατάλληλο σχήμα. Παίρνετε όλα τα συστατικά που χρειάζεστε για την επιτυχή σύνθεση πρώτος-σκελών cDNA, που κερδίζει το χρόνο σας και που εξασφαλίζει την επιτυχία σας με κάθε πείραμα. Η εξάρτηση αντίστροφο Transcriptase είναι μια έκδοση μ-MLV RT που έχει κατασκευαστεί για να μειώσει RNase Χ τη δραστηριότητα και να παρέχει την αυξανόμενη θερμική σταθερότητα. Το ένζυμο χρησιμοποιείται για να συνθέσει cDNA σε μια σειρά θερμοκρασίας 42-55°C, που παρέχει την αυξανόμενη ιδιομορφία, υψηλότερες παραγωγές του cDNA, και περισσότερου ολόκληρου προϊόντος από άλλα αντίστροφα transcriptases.

Εφαρμογές

Πρώτη σύνθεση σκελών cDNA για το rt-pcr

Κατασκευή των βιβλιοθηκών cDNA

One-step rt-pcr

Επέκταση εγχυτήρων

Σημαντικές σημειώσεις

Αποφυγή της μόλυνσης ριβονουκλεάσης

Η αγνότητα και η ακεραιότητα RNA είναι ουσιαστικές για τη σύνθεση του ολόκληρου cDNA. Το RNA μπορεί να υποβιβαστεί από RNase Α, το οποίο είναι ένας ιδιαίτερα σταθερός μολυσματικός παράγοντας που βρίσκεται σε οποιοδήποτε εργαστηριακό περιβάλλον. Όλα τα συστατικά της εξάρτησης έχουν εξεταστεί αυστηρά για να εξασφαλίσουν ότι είναι RNase-ελεύθερα. Για να αποτρέψουν τη μόλυνση και το εργαστηριακά περιβάλλον και τα αντιδραστήρια, όλες οι έτοιμες λύσεις πρέπει να είναι χωρίς RNases. Γενικές συστάσεις για να αποφύγει RNase τη μόλυνση:

• Η depc-απόλαυση όλοι οι σωλήνες και το σιφώνιο τοποθετεί αιχμή για να χρησιμοποιηθεί στη σύνθεση cDNA ή επικυρωμένο χρήση νουκλεάση-ελεύθερο labware.
• Η ένδυση φορά γάντια όταν το διαχειριζόμενο RNA και όλα τα αντιδραστήρια, ως δέρμα είναι μια κοινή πηγή RNases. Γάντια αλλαγής συχνά.
• RNase-ελεύθερα αντιδραστήρια χρήσης, συμπεριλαμβανομένου υψηλού - ποιοτικό νερό (π.χ., DEPC-αντιμετωπισμένο νερό).
• Χρησιμοποιήστε έναν RNase ανασταλτικό παράγοντα, όπως Dongsheng RNasin (#R2011) για να προστατεύσετε το RNA από τη δραστηριότητα RNases.
• Κρατήστε όλα τα τμήματα εξαρτήσεων στενά σφραγισμένα όταν όχι σε λειτουργία. Κρατήστε όλους τους σωλήνες κλειστούς στενά κατά τη διάρκεια της αντίστροφης αντίδρασης μεταγραφής.

RNA προτύπων

Το συνολικό κυψελοειδές RNA που απομονώνεται με τις τυποποιημένες μεθόδους είναι κατάλληλο για τη χρήση με την εξάρτηση. Το καθαρισμένο RNA πρέπει να είναι χωρίς άλατα, ιόντα μετάλλων, αιθανόλη και φαινόλη να αποφύγει την αντίδραση σύνθεσης cDNA. Οι μολυσματικοί παράγοντες ιχνών μπορούν να αφαιρεθούν από την πτώση αιθανόλης του RNA που ακολουθείται από δύο πλυσίματα του σβόλου με την κρύα αιθανόλη 75%. Για τις εφαρμογές rt-pcr, το RNA προτύπων πρέπει να είναι χωρίς μόλυνση DNA. Πριν από τη σύνθεση cDNA, το RNA μπορεί να αντιμετωπιστεί με DNase Ι για να αφαιρέσει τα ποσά ιχνών του DNA. DNase πρέπει να ληφθώ από το χρήστη. Πάντα εκτελέστε μια αντίδραση ελέγχου (RT-μείον) που περιλαμβάνει όλα τα συστατικά για το rt-pcr εκτός από το αντίστροφο ένζυμο transcriptase.

RNase Χ πέψη

Η ευαισθησία του PCR βήματος μπορεί να αυξηθεί (ειδικά για τα μακριά πρότυπα) με την αφαίρεση του προτύπου RNA από το cDNA: Υβριδικό μόριο RNA από την πέψη με RNase Χ μετά από τη σύνθεση πρώτος-σκελών. Η παρουσία RNase Χ κατά τη διάρκεια της σύνθεσης πρώτος-σκελών θα υποβιβάσει το πρότυπο mRNA, με συνέπεια τη μειωμένη ολόκληρη σύνθεση cDNA και τις μειωμένες παραγωγές του πρώτος-σκέλους cDNA.

Εγχυτήρες

Η σύνθεση του πρώτου σκέλους cDNA μπορεί να εμπυρευματιστεί με είτε τον οληγο (DT) εγχυτήρα 15, τους τυχαίους εγχυτήρες είτε τους γονίδιο-συγκεκριμένους εγχυτήρες.

Οληγο (DT) 15 εμπυρευματίζουν cDNA τη σύνθεση από την πολυ ουρά (Α) παρούσα στα 3 " - τέλος ευκαριωτικό mRNA. Οι τυχαίοι εγχυτήρες αρχίζουν cDNA τη σύνθεση από το συνολικό πληθυσμό RNA (rRNA και mRNA). Επομένως, η χρησιμοποίηση των τυχαίων εγχυτήρων για την πρώτη σύνθεση σκελών οδηγεί σε μια μεγαλύτερη πολυπλοκότητα παραγμένη cDNA έναντι του οληγο (DT) εγχυτήρα 15. Κατά συνέπεια, η ευαισθησία και η ιδιομορφία των επόμενων PCR αντιδράσεων μπορούν να μειωθούν. Εντούτοις, υπάρχουν διάφορες εφαρμογές όπου είναι ευεργετικό να χρησιμοποιηθούν οι τυχαίοι εγχυτήρες, όπως η σύνθεση cDNA που χρησιμοποιεί mRNAs χωρίς μια πολυ ουρά (Α), ή cDNA χρησιμοποίηση σύνθεσης πολυ (Α) - εμπλουτισμένα δείγματα RNA.

Οι γονίδιο-συγκεκριμένοι εγχυτήρες χρησιμοποιούνται για να συνθέσουν το συγκεκριμένο cDNA από μια ομάδα του συνολικό RNA ή mRNA και πρέπει να ληφθούν από το χρήστη.

Πρώτα - διαδικασία σύνθεσης σκελών cDNA

Ο πρώτος - η αντίδραση σκελών cDNA μπορεί να εκτελεσθεί ως μεμονωμένη αντίδραση ή ως σειρά παράλληλων αντιδράσεων με τα διαφορετικά πρότυπα RNA. Επομένως, το μίγμα αντίδρασης μπορεί να προετοιμαστεί με να συνδυάσει τα αντιδραστήρια χωριστά ή ένα κύριο μίγμα που περιέχει όλα τα συστατικά εκτός από το RNA προτύπων μπορεί να προετοιμαστεί. Ανάλογα με τη δομή του προτύπου RNA, τα χωριστά βήματα για την αλλοίωση RNA και την ανόπτηση εγχυτήρων μπορούν να βελτιώσουν τα αποτελέσματα rt-pcr.

Πρωτόκολλο

Ι. Πρώτη σύνθεση σκελών cDNA

1. Προσθέστε τα ακόλουθα αντιδραστήρια σε έναν αποστειρωμένο, νουκλεάση-ελεύθερο σωλήνα στον πάγο στην υποδεδειγμένη διαταγή:

2. Το μίγμα ήπια, υποβάλλει σε φυγοκέντρωση εν συντομία και επωάζει σε 70°C για 5 λεπτά ψύχρας στον πάγο, περιστροφή κάτω και τοποθετεί το φιαλίδιο πίσω στον πάγο.

3. Προετοιμάστε το ακόλουθο μίγμα σύνθεσης cDNA, προσθέστε τα ακόλουθα συστατικά στην υποδεδειγμένη διαταγή:

4. Το μίγμα ήπια και υποβάλλει σε φυγοκέντρωση εν συντομία.

5. Για οληγο (DT) ₁₅, επωάστε για 60 λ. σε 42°C. Για την τυχαία hexamer εμπυρευματισμένη σύνθεση, επωάστε για 60 λ. σε 37°C.

6. Ολοκληρώστε την αντίδραση με τη θέρμανση σε 70°C για 5 λεπτά.

Το αντίστροφο προϊόν αντίδρασης μεταγραφής μπορεί να χρησιμοποιηθεί αμέσως στις δεύτερες αντιδράσεις σύνθεσης σκελών cDNA ή να αποθηκευτεί σε -20°C για μια λιγότερο από εβδομάδα. Για την πιό μακροχρόνια αποθήκευση, -70°C συστήνεται.

ΙΙ. PCR ενίσχυση του πρώτου σκέλους cDNA

Το προϊόν της πρώτης σύνθεσης σκελών cDNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί άμεσα PCR ή qPCR. Ο όγκος του πρώτου μίγματος αντίδρασης σύνθεσης σκελών cDNA δεν πρέπει να περιλάβει το περισσότερο από 1/10 του συνολικού PCR όγκου αντίδρασης. Κανονικά, 2 μl του πρώτου μίγματος αντίδρασης σύνθεσης σκελών cDNA χρησιμοποιούνται ως πρότυπο για επόμενο PCR στο συνολικό τόμο 50 μl.